摘要：随着生物技术的发展, 越来越多的蛋白和多肽被用于临床治疗, 其中中枢神经系统疾病的治疗是研究的热点。但蛋白多肽类药物存在跨血-脑屏障能力弱、易降解、生物利用度低等缺点而影响其临床应用。随着脑靶向给药技术的发展, 蛋白多肽类药物在中枢神经系统疾病的治疗中将发挥越来越重要的作用。本文对蛋白多肽类药物脑靶向修饰给药、纳米脑靶向递药等技术的进展及发展趋势进行了综述。
关键词： 蛋白多肽 血-脑屏障 化学修饰 纳米递送系统
近年来, 随着生物技术的不断进步, 生物大分子药物如蛋白质和多肽类药物受到越来越多的关注。与传统的化学合成药物相比, 蛋白多肽类药物的优点显著: 它们与体内正常生理物质十分接近, 易被机体吸收, 药理活性高、针对性强、毒性低。目前, 已经上市销售的蛋白多肽类药物超过100 种, 且更多的药物正处于临床和临床前研究中［1］。
大量研究表明蛋白多肽类药物对中枢神经系统 (Central nervous system, CNS) 疾病如脑肿瘤、阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 、帕金森病 (Parkinson's disease, PD) 、疼痛等的治疗具有巨大的应用前景。然而, 由于其分子大小、极性、亲水性和带电性等问题使之缺乏细胞膜渗透力, 难以如小分子一样穿越细胞膜, 通过生理屏障, 亦不能透过血脑屏障 (Blood-brain barrier, BBB) 。此外, 这类药物还存在稳定性差、半衰期短, 易被体内蛋白酶或多肽酶降解等缺点, 极大地限制了其应用。因此, 发展智能化的蛋白多肽类药物递送系统, 保护其结构和稳定性及实现靶向输送成为制剂学的重要研究方向。
展开剩余88%为实现药物对CNS疾病的治疗, 最重要的是要让药物跨过BBB进入脑内并在病变部位蓄积。目前, 药物的脑靶向策略有多种, 本文就提高蛋白多肽类药物稳定性及跨BBB入脑能力, 从化学修饰及纳米递送系统两方面对近年的研究进展予以综述。
1 脑靶向化学修饰策略BBB是人体的重要生理屏障, 主要由脑毛细管内皮细胞 ( Brain microvessel endothelial cells, BMEC) 紧密连接形成, 维持着大脑内环境稳定等功能。BBB阻挡了血液中内源性和外源性有害物质进入脑内, 同时也阻碍了药物进入CNS［2］。因此, 透BBB制剂一直是药剂学研究的热点。
对蛋白多肽类药物进行适当的化学修饰可提高其入脑效率, 本文将分别介绍阳离子化、细胞膜穿透肽 ( cell penetrating peptides, CPP) 、脑靶向受体和多聚物修饰对其跨BBB的影响。此外, 通过糖基化、甲基化、卤化、脂酰化等增强药物脂溶性也是提高其跨BBB能力的重要策略。
1.1 阳离子化修饰
BMEC膜表面带负电荷, 对药物进行适当的阳离子化修饰, 可以通过正负电荷的吸附效应, 提高药物透BBB效率。20世纪80年代, Kumagai等[3]就证实, 将阳离子白蛋白连接β-内啡肽, 形成的嵌合物能够迅速与离体牛BMEC结合, 经内吞作用进入细胞。后期更多研究发现, 对蛋白和多肽如超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD) 、胰岛素、白蛋白、Ig G和神经营养因子等进行阳离子化修饰, 能够增加这些蛋白及多肽透BBB的效率, 提高脑对这些物质的摄取[4]。SOD经过多胺修饰, 带上正电荷, 经静脉给药后,对全脑缺血的大鼠可以起到神经保护效应[4]。
但是, 阳离子化药物与BMEC相互作用穿过BBB的具体机制至今尚未阐明, 此外, 阳离子化药物存在潜在毒性, 都限制了此策略的临床应用。
1.2 CPP修饰
CPP是一类长短不等、具有快速穿透细胞膜能力的多肽片段, 它们富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸残基, 使其带正电荷。研究最多的CPP是Ⅰ型HIV的逆转录激活因子 (HIV-1 TAT) , TAT肽含86个氨基酸, 由2个赖氨酸残基和6个精氨酸残基构成了其渗透细胞膜的必需区域, 其透膜机制是通过与膜磷脂上负电荷相互作用, 造成磷脂双分子层的不稳定, 并形成倒置微团结构进入细胞。TAT的优点在于, 高效转运药物的同时能够有效保护药物的生物活性[5]。
Schwarze等[6]将TAT连接半乳糖苷酶, 此复合物经静脉注射小鼠2 h后, 免疫组化检测到在脑微血管中的分布, 4~8 h检测到在脑实质中出现。此项研究奠定了TAT携带蛋白透BBB研究的基础。其后, Dietz等[7]将TAT连接神经胶质源神经营养因子用于PD小鼠的治疗, Yin等[8]将TAT与凋亡抑制蛋白Bcl-x L融合, 用于小鼠脑缺血的治疗, Zhang等[9]将TAT和减肥激素Leptin结合, 用于小鼠肥胖症的治疗, 这些研究都证实了TAT有效透BBB, 保护药物活性的效果。
其他的CPP如RVG、polyarginine11R等也常被用于研究蛋白多肽类药物跨BBB转运[10, 11]。然而, CPP具有一定的神经毒性、诱导BMEC凋亡及诱发炎症, 此外, 其穿膜效应具有非选择性, 能导致药物在外周组织蓄积。
1.3 多聚物修饰
多聚物包括亲水性聚乙二醇 (PEG) 、两亲性的聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物 (Pluronic) 和聚 (2-噁唑啉) 类嵌段共聚物 (Poly (2-oxazoline) , POx) 常用于蛋白多肽类药物修饰。PEG化修饰是将合适的PEG链通过共价键结合到蛋白或多肽上, 可提高药物在血浆中的稳定性、延长其半衰期、提高生物利用度, 同时降低免疫原性。报道称PEG化蛋白通过提高血浆生物利用度, 延长了其暴露BMEC的时间, 从而增加细胞对药物的摄取。然而, 并未有研究报道PEG化后脑对药物的摄取量增加, 原因可能是PEG化增加了蛋白和多肽的分子量和疏水性, 不利于药物穿透细胞膜屏障[12]。
两亲性嵌段共聚物修饰同样也能够提高蛋白多肽的生物利用度和透BBB能力。Pluronics能够穿过BBB进入脑内, 某些Pluronics是P-糖蛋白的强力抑制剂, 并能够以病原体的形式被BMECs和神经元吸收。辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase, HRP) 作为工具蛋白常被用于Pluronics透BBB效率及机制的研究, 胰岛素及SOD1与Pluronics嵌段共聚物连接后也能增加其透BBB效率并提高对脑疾病的治疗效果[1]。近期, 用于Pluronics修饰研究较热的是Leptin。Leptin与Pluronic P85连接形成复合物, 经静脉注射, 小鼠脑内leptin含量显著增加, 并减少肥胖小鼠的摄食量, 起到良好的减肥效果[13]。POx类嵌段共聚物穿透细胞膜的机制与Pluronic类相似, 其与蛋白的连接产物更稳定, 生物相容性更好, 安全性更高, 且便于修饰。目前, 作为载药系统研究较多的有聚 (2-甲基-2-噁唑啉) 和聚 (2-乙基-2-噁唑啉) , 已经进入临床评价阶段[12]。
1. 4 脑特异性配体的修饰
构成BBB的BMEC上存在着诸多的受体和转运子, 用以转运激素、氨基酸、葡萄糖等物质入脑。将这些受体的配体或抗体与蛋白多肽类药物结合, 经受体转运途径入脑, 是实现药物脑靶向递送的重要策略, 又称为“特洛伊木马”策略。
1.4.1 转铁蛋白受体 (Transferrin receptor, Tf R) BMEC上含有丰富的Tf R, 采用Tf或Tf R抗体修饰药物能够有效地实现跨BBB转运。但外源性Tf与内源性Tf存在着竞争性抑制关系, 可能会影响机体对Tf的正常转运, 因此, 目前对Tf修饰载药系统的研究较少。Tf R抗体和Tf R结合位点不同于Tf, BBB上Tf R的表达也非常丰富, 所以成为研究最热的脑靶向功能分子之一。将Tf R的小鼠单克隆抗体OX26连接碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) , 经注射给药, b FGF在大鼠脑中蓄积量是修饰前的5倍, 并且大幅度的降低脑缺血梗死面积, OX26与表皮生长因子、血管活性肠肽、脑源性神经营养因子等蛋白多肽类药物连接也取得了好的跨BBB效应和疗效[14, 15]。Tf R的另一个抗体CTf RMAb作为脑靶向功能分子与多种蛋白多肽类药物连接也获得了较好评价[14]。但是, 有研究发现Tf R抗体载药系统被BMEC摄取后并不能入脑, 而是“滞留”在BMEC内[16]。为解决这一问题, 研究者们又开发出低亲和力Tf R抗体和双特异性抗体递送系统[16, 17]。将低亲和性Tf R抗体的Fab片段与β-分泌酶抗体的Fab片段连接, 用于小鼠AD治疗, 结果显示双抗体跨BBB的能力显著高于Tf R抗体, 并降低淀粉样β蛋白 (Amyloidβ, Aβ) 水平[18]。
1.4.2 胰岛素受体 (Insulin receptor, Ins R) BMEC的Ins R与胰岛素结合, 确保其能够穿透BBB进入脑内, 维持脑内能量代谢。因为存在高糖血症的风险, 胰岛素并不能作为脑靶向功能分子。Boado等[19]将Ins R抗体融合单链Aβ抗体用于AD的治疗, 体内研究显示融合后的抗体能够迅速透过罗猴的BBB进入脑内。研究表明Ins R抗体可以融合胶质细胞源性神经营养因子、肿瘤坏死因子受体、促红细胞生成素、硫酸胺酶、硫酸酯酶等蛋白用于CNS疾病的治疗[20-22]。然而, 考虑到Ins R抗体对机体糖代谢的影响可能影响到其临床应用, 此受体介导的脑靶向策略研究热度有所下降。
1.4.3 低密度脂蛋白受体相关蛋白(Low density lipoprotein receptor-related protein, LRP) LRP超级家族中的LRP1和LPR2属于Ⅰ型跨膜蛋白, 多种配体可以与LRP1或LRP2结合, 以受体介导的方式进入细胞, 这些配体也常作为靶向分子用于跨BBB研究。凝集素肽 (Angiopep-2) 、黑色素瘤抗原P97、载脂蛋白E (apolipoprotein E, Apo E) 、受体相关蛋白等, 都被证实能通过LRP携带蛋白多肽类药物入脑[23-27]。Demeule等[24]最新研究显示, 膜不透性的神经降压素与Angiopep-2经化学连接, 其透BBB的效率至少是未修饰神经降压素的10倍, 且对福马林诱导的大鼠持续性疼痛有剂量依赖性镇痛作用, 并能逆转神经、骨癌引起的疼痛。由Angiopep-2与紫杉醇连接的药物ANG1005, 已经完成Ⅰ期临床评价[28]。P97 (又称Melanotransferrin, MTf) , 为Tf同系物, 可通过LRP1受体介导跨BBB入脑。MTf与柯萨奇病毒-腺病毒受体的融合蛋白可调整血清-5型腺病毒载体的细胞转运途径, 利于其跨BBB转运[29]。MTf携带生物活性分子如溶酶体酶、抗体等治疗CNS疾病正在研究中, 展现出良好的应用前景[30]。
2 脑靶向纳米递释系统策略纳米递释系统, 通过包覆或连接蛋白多肽类药物, 可提升其稳定性, 避免被酶解, 延长体循环时间, 降低免疫原性, 提高生物利用度, 达到控释、缓释效应, 且易于修饰, 因此在药物脑靶向递送中占据重要地位。
脂质体、聚乳酸-聚羟基乙酸 ( PLGA) 是目前研究最多的蛋白多肽类药物载体, 此外, 聚氰基丙烯酸正丁酯〔poly ( butyl cyanoacrylate) , PBCA〕纳米粒、固体脂质纳米粒、PEG化聚乳酸 ( PEG-PLA) 、PEG化聚几内酯 ( PEG-PCL) 、无机纳米粒子等诸多载体也被用于蛋白多肽类药物脑靶向递送的研究。
2.1 脂质体
脂质体是研究最为广泛的纳米递送系统之一, 取得较好的应用效果, 多种脂质体纳米制剂已经应用于临床。然而, 未经修饰的脂质体易被体内网状内皮系统快速清除, 很难进入CNS, 所以常对脂质体进行修饰, 以延长其体循环时间及实现靶向递送等。
谷胱甘肽 (Glutathione, GSH) 修饰PEG化的脂质体, 可包载阿片肽DAMGO用于疼痛的治疗, 包载糖皮质激素类药物甲泼尼龙用于脑部炎症的治疗, 包载Aβ抗体片段用于AD的治疗[31-33]。这些研究结果都显示GSH-PEG脂质体能增加蛋白多肽类药物进入脑内的绝对量, 延长药物作用时间, 增强药物疗效。Sharma等[34]报道了一种双功能脂质体递送系统, 此系统在PEG化脂质体上连接Tf以及聚-L-精氨酸, 研究结果显示, BMEC对此双功能脂质体的摄取是未修饰和单纯Tf修饰脂质体的2~4倍。其它特异性脑靶向配体如载脂蛋白E (Apo E) 、Tf等修饰脂质体用于蛋白多肽类药物的脑部递送也多有报道[35, 36]。此外, 一种新型脂质体多囊脂质体由于含有95%以上的水性成分, 非常利于蛋白多肽类药物的包封和运输, 也受到了较多关注, 然而鲜有报道多囊脂质体运输蛋白多肽类药物靶向CNS[2]。
2. 2 PLGA纳米粒
PLGA由于其良好的生物相容性和可降解性被广泛用于载药系统的研究。PLGA纳米粒可实现所载药物的持续性释放, 非常适用于脑部慢性疾病的治疗。载SOD1 的PLGA纳米粒用于治疗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤, 可保护神经元细胞, 减少脑部坏死面积［37］。PLGA纳米粒易于修饰, 对PLGA纳米进行特定的修饰, 如PEG、乳铁蛋白 ( Lactoferrin, Lf) 、CPP等可延长其体内半衰期及增强脑靶向性。Lf修饰的PEG-PLGA运载神经保护肽S14G-humanin或urocortin分别用于AD和PD的治疗, 起到良好的神经保护效应［38，39］。噬菌体展示肽技术筛选出的TGN肽作为脑靶向功能分子连接PEG-PLGA纳米粒, 包载神经保护肽NAP, 此TGN-PLGA / NAP纳米药物用于小鼠AD模型, 显著提高神经保护效应以及小鼠空间学习能力［40］。这些研究都表明, PLGA适用于运载蛋白多肽类药物, 对CNS疾病的治疗具有非常好的应用前景。
2.3 PBCA纳米粒
PBCA被认为是最成功的脑靶向纳米递送系统之一。PBCA经聚山梨酯-80修饰, 可提高跨BBB效率, 此纳米粒连接神经生长因子, 经静脉注射可提高小鼠脑对药物的摄取, 减轻PD的症状[41]。聚山梨酯-80修饰的PBCA连接HRP、增强绿色荧光蛋白 (enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP) 等蛋白, 静脉注射脑创伤小鼠, 经免疫组化鉴定, HRP或EGFP在损伤区域有较高分布。Reukov等[42]将葡聚糖及聚山梨酯-80修饰PBCA纳米粒, 并共价连接SOD1和谷氨酸N-甲基天冬氨酸受体1的抗体, 此复合物可逆转超氧自由基诱导的神经元死亡。上述研究皆表明, 聚山梨酯-80修饰的PBCA纳米粒具有携带大分子药物包括蛋白多肽类药物靶向入脑的能力[41, 42]。然而, 鉴于PBCA的毒性, 以及静脉注射PBCA纳米粒入脑机制尚不清楚, 此类聚合物仍未被美国FDA批准用于人体。
2. 4 无机纳米载药系统
和有机高分子纳米材料不同, 氧化铁纳米粒子、金纳米粒子 ( Au) 、介孔二氧化硅等无机纳米粒子具有比表面积大、大小形貌可控性好等优点, 同时这些粒子独特的光、电、磁等性质赋予其潜在的显影成像、靶向递送和协同治疗等功能, 引起了越来越多的关注。无机纳米载药系统也成为了研究的热点, 尤其在肿瘤诊断及靶向治疗方面, 取得了较好的进展。对无机纳米粒子进行修饰, 可增强其透BBB能力, 靶向脑部疾病如脑胶质瘤等的治疗［43，44］。近期, Gao等［45］报道了无机纳米粒子载多肽药物治疗AD的研究。此研究以Au纳米粒为载体, 偶联抑制Aβ 聚集的多金属氧酸盐以及分解Aβ 纤维生成的多肽LPFFD, 此复合物能够抑制Aβ 聚集、分解Aβ 纤维、降低Aβ 介导的过氧化物酶活性及Aβ 诱导的细胞毒性, 此外借助Au纳米粒子的跨膜效应, 增加药物的脑部蓄积, 实现了AD的有效治疗。
无机纳米粒子用于载蛋白多肽类药物的研究起步较晚, 鉴于其优点以及蛋白多肽类药物的重要性, 蛋白多肽类药物无机纳米递送系统将会有广阔的发展空间。此外, 无机纳米材料和有机高分子材料结合形成的杂合材料纳米递送系统越来越受关注, 也必将成为蛋白多肽类药物的重要递送系统。
3 结语蛋白多肽类药物的快速发展, 为CNS疾病治疗带来了机遇, 同时也面临着诸多的挑战。通过对蛋白多肽的结构修饰或利用各种靶向递送系统, 蛋白多肽类药物的脑靶向给药具有很好的发展前景。除此之外, 短暂破坏BBB结构以改变其通透性、改变给药途径也是增加蛋白多肽类药物脑靶向输送的重要策略。其中, 鼻腔给药由于能够使药物绕过BBB, 直接进入脑内, 备受研究者们的关注。透BBB给药一直是药剂学研究的热点, 国际药学界普遍认为: 随着研究的深入, 近10 年或20 年内高效透BBB给药系统必将出现。有理由相信蛋白多肽类药物脑靶向给药也必将取得快速发展, 为CNS疾病患者带来福音。
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